Annexin V, TRITC标记

膜联蛋白V是研究细胞凋亡的有价值的工具。它用作检测在细胞表面表达磷脂酰丝氨酸的细胞的探针，这是细胞凋亡以及其他形式的细胞死亡中发现的特征。有多种参数可用于监测细胞活力。Annexin V-dye共轭物被广泛用于通过测量磷脂酰丝氨酸（PS）的转运来监测细胞凋亡。在细胞凋亡中，PS转移到质膜的外部小叶。磷脂酰丝氨酸在细胞表面的出现是细胞凋亡初始/中间阶段的普遍指标，可以在观察形态变化之前进行检测。这种荧光TRITC-Annexin V偶联物广泛用于通过流式细胞仪或荧光显微镜监测细胞凋亡。对于基于膜联蛋白V的细胞凋亡检测的微孔板检测，我们建议您使用Cell Meter™试剂盒。

操作步骤

1.用膜联蛋白V缀合物制备和孵育细胞：

1.1     制备膜联蛋白V缀合测定缓冲液：10mM HEPES，140mM NaCl和2.5mM CaCl ₂，pH 7.4。

1.2     用测试化合物处理细胞一段所需的时间（用星形孢菌素处理的Jurkat细胞4-6小时）以诱导细胞凋亡。

1.3     离心细胞，得到1-5×10 ⁵个细胞/管。

1.4     将细胞重悬于200μLAnnexin V结合测定缓冲液中（来自步骤1.1）。

1.5     在细胞中加入2μL膜联蛋白V结合物。

可选：在细胞内加入死细胞染色剂如碘化丙锭，用于坏死细胞。

1.6     余ncubate在室温下进行30至60分钟，避光。

1.7     在用流式细胞仪或荧光显微镜分析细胞之前，加入300μLAnnexin V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）以增加体积（参见下面的步骤1.8）。

1.8     使用流式细胞仪或荧光显微镜监测荧光强度（参见下面的步骤2或3）。

2.使用流式细胞仪分析：

通过使用具有适当过滤器的流式细胞仪来量化膜联蛋白V缀合物。

注意：粘附细胞上的膜联蛋白V 结合流式细胞术分析未经常检测，因为在细胞分离或收获期间可能发生特定的膜损伤。

3.使用荧光显微镜分析：

3.1     移液器从步骤1.6，将细胞悬浮液冲洗1-2次用甲nnexin V-结合测定缓冲液（来自步骤1.1） ，然后与A重悬细胞 nnexin V-结合测定缓冲液（来自步骤1.1） 。将细胞添加到盖有玻璃盖玻片的载玻片上。

注意：对于粘附细胞，建议直接在盖玻片上生长细胞。与膜联蛋白V缀合物（步骤1.6）孵育后，用Nnexin V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）冲洗1-2次，并将A nnexin V结合测定缓冲液（来自步骤1.1）加回到盖玻片中。在玻璃载玻片上翻转盖玻片并观察细胞。在与膜联蛋白V缀合物孵育后，细胞也可以在2％甲醛中固定，并在显微镜下观察。

3.2     在荧光显微镜下用适当的滤光片分析膜联蛋白V缀合物的凋亡细胞。